第13章　ラムダファージの感染サイクル

　ファージを最初に実験的に扱ったのはカナダ系フランス人の d'Herelle（1917）である。彼は、ファージは細菌に外から（exogenous）感染するウイルスであると認識していた。一方、当時名声を誇っていたベルギーの Bordet は、ある種の細菌は他の菌に感染するファージを生産出来る能力を内在（endogenous）すると考えていた。

　これは、前者は T4 や T7 などの virulent phage を扱い、後者はこの章で述べる lysogenic phageを研究対象にしていた為である。お互いに別のファージを研究していた事に気付かず、d'Herelle は、「Bordet はファージ粒子の混入した菌をいじっているからあんな結論を出すのだ」と考えていた。

　ファージの研究から分子生物学を作り上げたDelbrück のファージグループは前者のファージを対象に選び研究を構築して行った為、lysogeny（溶原化）の現象はなかなかこのグループに認められなかった。（J. Cairns, G.S. Stent, S.D. Watson Phage and Origins of Molecular Biology, 1996, CSHLQB）。溶原化の現象の本質を初めて明かにしたのはロシアからフランスに移民した Lwoff（1950）である。

13−1：DNA 複製

　ラムダファージはウイスルス粒子の中では直鎖２重鎖 DNA の形をとっている。両端に cohesive endという部位があり、お互い相補的な12 塩基分が１本鎖となって２重鎖から飛び出している。飛び出している鎖は５'側である。

　大腸菌に感染すると、cohesive end はお互いに水素結合し、ラムダ DNA は環状になる。Ori から左右両方向にDNA 複製が進行する（θtype replication）。

　ウイルス粒子が出来る溶菌サイクルでは、やがて、rolling circle replication が始まり、ラムダ DNAが同方向に沢山つながった concatamer が出来る。ファージ蛋白は cos を認識し、ラムダ DNA を１ユニットづつファージの頭に詰め込んで行く。

　一方、溶菌サイクイルに入らず、ラムダ DNA が大腸菌染色体に組み込まれるサイクルを取る場合がある。これを溶原サイクル（lysogenic cycle）と云う。環状ラムダ DNA は att と云う場所を利用し染色体に組み込まれ、その後大腸菌 DNAの一部として複製される。大腸菌染色体上の組み込み部位は gal と bio の間のattB site にほぼ限定されている。 ファージ側（attP）も大腸菌染色体側（attB）も組み替え部位が決まっているので部位特異組み換えの一つと云える。attPと attB には AT の多い共通の 15 塩基対がある（図13-1-(1)）。

　組み込みにはラムダファージの int 蛋白（＋宿主蛋白）が必要とされる。att はラムダ遺伝子地図のほぼ真中にある。従ってウイルス粒子内では鎖の反対側で cos 近傍にあった遺伝子（ファージ頭遺伝子と溶菌遺伝子Ｒ）は組み込まれたラムダ遺伝子では隣合わせになり、ウイルス粒子内のゲノムでatt を挟み隣合っていた遺伝子（int と sib）は両端に離れる。この様な組み込みのモデルを提出したのは Campbell である（図13-1-(2)）。

13−2：Genetic Switch

　溶原サイクルと溶菌サイクルはどのように調節されているのだろうか？そこで発現する遺伝子は同じである筈はない。いずれかのサイクルへのスイッチがある筈である。又、溶原サイクルに入り染色体に組み込まれたラムダ遺伝子の発現はどうであろうか？ラムダ遺伝子には溶菌を起こす遺伝子がある。どうしてラムダ遺伝子を組み込んだ大腸菌は溶菌しないのか？

13-2-1：溶菌サイクルで発現している遺伝子

　溶菌サイクルでは次の様な一連の遺伝子の発現が見られる。ラムダファージが大腸菌に感染すると、２つのプロモーターPL と PR から左右両方向に転写が始まる。それぞれ Nと cro遺伝子を読み終ると、ρ依存性に転写は停止する。N 蛋白はこの ρ依存性転写停止を抑える機能（anti-termination;前出）があるので、N 蛋白が翻訳されると、さらに、左方向に、cIII、xis、int と転写され、右方向には cro、cII、O、P、Q、と転写され、停止する（図13-2-1）。

13-2-2：溶原サイクルで発現している遺伝子

　溶原サイクルにコミットした状態ではどの遺伝子が転写されているかを見てみる。

　溶原サイクルでは、cI, int の２つの蛋白だけが作られる。int はラムダ DNA の染色体への組み込みに関与する酵素である。cI はPL , PR 両方からの転写開始を抑えるレプレッサー遺伝子である。溶原サイクルにあっては、cI の発現によりラムダファージが増殖するのに必要な蛋白は一切出来ない（図13-2-2）。

　cI はPL , PR の間に位置し、PRE と PM （PRのすぐ左：図13-2-5）２つのプロモーターから左方向に転写される事が出来る。つまり、５'非コード領域のサイズの異なる２種の mRNA が出来るが、翻訳された蛋白は同じである。

13-2-3：溶原化と溶菌化の分かれ目

　溶菌サイクルでは、上に述べたように、左の N、cIII、 xis、 右にcro、 cII、 O、 P、 Q,、lysis、tail、 head などの遺伝子が発現している。この時 cII も発現しているので、cIの転写が促進され、溶原サイクルも動いてよい筈である。しかし、その様な事は起こらない。何故か。

　上の説明では省略したが、溶原化を抑え溶菌サイクルにもって行く上で大きな役割をするのは cro である。cro は小量でも cI の PM からの転写を抑える。よって、cro がcI の PM オペレーター（＝PROR、後述）についてしまうと、cIIがPREからの発現を誘導しcIを合成しても、安定したPM からのcI の転写は不可能となる。

　一方、溶菌サイクルを押さえ溶原サイクルに入るには、まず、cIIが作られPREに結合し、cIの遺伝子の転写を高める必要がある。しかし、cIIは大腸菌のHflA蛋白(High Frequncy Lysogenization) により分解される非常に不安定な蛋白である。そこで、溶原化過程ではもう一つの因子cIIIが促進的に働き、cIIの分解を防いでる。

　cIIを壊すHflA蛋白は、細胞が元気に増殖している時は活性が高くなり、結果として cII は不安定になる。つまり、溶菌サイクルに入り易い。菌の栄養状態が悪くなるとHflA蛋白分解酵素活性が下がり、より溶原化しやすくなる。云いかえると細胞の生理的条件がcIIの安定性に関与し、さらには溶原化するか否かを決める（図13-2-2、図13-2-3）。

13-2-4：プラック変異ファージ

　野生株のラムダファージを大腸菌に感染させると濁ったプラックが出来る。これは、感染が広がる（溶菌サイクル）間に、溶原サイクルの感染が起こり、生存した菌が増殖する為である。良くみると、プラックの真中に生き残った菌がヘソのようにかたまって見える。稀に透明（clear）なプラックを観察する事がある。

＜問い＞clearプラックしか作らないファージはどのような変異を持っているか？

＜問い＞cro が不活性化されるとどんなプラックを作るか？cro もcI も不活性化されると、どうなるか？

＜問い＞ラムダファージが溶原化した菌にラムダファージを更に感染させてもプラック（溶菌斑）は出来ない。何故か。

13-2-5：溶原化と溶菌化の分かれ目ー続き

　溶原化のスイッチにおいて、PM からの cI 転写は cro により負に制御され、PR からの cro 転写は cI により負の制御される。CI、croどちらが OFF になるかは、cro 或は cI の量に依存する。

　PM のプロモーター 領域は左から OR3､ OR2､OR1 の３つの領域からなる。cI は右端の OR1に先ず付き､次にOR2､OR3 の順に付く。OR1に cI が付くと、右方向の転写プロモーターにポリメラーゼが寄り付けず、cro 以降の転写が止まる。しかしこの状態ではPMからのcIの転写はない。更に、cI が増加し OR2 まで付くと、cIが左方向の転写プロモーターにRNAポリメラーゼをリクルートし、cIの転写が始まる。cIが更に増加し、OR3 までつくと、ポリメラーゼの付く部分が無くなり、cIの転写も止まる。つまり、溶原化の定着には、溶菌化に行く反応を抑えるだけでは不十分で、cIの蓄積が必要である。遊びのあるアクセルのような感じである（図13-2-5）。

　溶原サイクルと溶菌サイクルではint, xis の発現が異なる。溶原サイクルでは、cII が xis のコード領域内にある Pint からの転写を開始させる。これは、N 蛋白による anti-terminationを経た転写ではないので、int を転写しそこで転写は終了する（図13-2-2）。一方溶菌サイクルではN蛋白によるanti-terminationを経た転写なのでsibの終りまで転写が進み､retro regulationでmRNAが分解され intをコードする配列が失われる（図13-2-2上）。

13-2-6：誘導（induction）

　溶原化したファージはUV照射 で誘導（induction）される。この時ファージゲノムは染色体DNAから切り出される（excision）。ゲノムの切り出しには、int､ xis両方が必要である。

　溶菌サイクルであるから、Nの発現がありanti-termination によりPL からint迄転写が進む。ところが、ファージの組み込み部位 att は、int とsib の間にあるので、組み込まれたゲノムではちょうど att と sib はファージゲノムの左右反対に位置する事となる。よって、この場合は転写産物にsibの配列はないのでretro regulation(前出)を受けずxisとint を両方をコードするmRNAが発現する事となる（図13-1-(2)）。

13−3：特殊形質導入

　gal⁻或いはbio⁻の大腸菌がこの様なファージによって溶原化されると、galあるいはbioの遺伝子もファージ遺伝子と一緒に入ってくるのでgal^＋あるいはbio^＋となる。特定の形質を導入するので、特殊形質導入(specialized transduction）と云う（図13-3）。

13−4：一般形質導入

　バクテリオファージの粒子はファージ自身のゲノムを包み込んでいる。即ち、ファージのDNAとファージ以外のDNAを識別する機構がある筈である。ラムダファージの場合は、cos遺伝子配列がファージの蛋白により特異的に認識され、cosを持つDNAのみがファージ粒子に組み込まれる。

　しかし、何等かの理由でこの認識が正確でない場合にはファージ以外のDNA、つまり宿主のDNA、がファージ粒子に包み込まれるであろう。その様なファージが他の菌に感染すれば、ファージが増殖した宿主である菌のDNAが他の菌に導入されることになる。

　そのような例として、P22ファージの増殖を考えてみる。

（1）P22 ファージ粒子中には、2重鎖直鎖のゲノムDNAがある。T4 ファージと同様粒子中ゲノムの両末端に遺伝子の重複があり、しかもcircularly permutateしている（ファージ遺伝子中の遺伝子がabcdeと並んでいるとすると、ファージ遺伝子中の遺伝子はabcdea、bcdeab、cdeabc、等となっている）。

（3）しかし、宿主細菌のDNAにもpacに似た配列が10-15コあり、低い頻度ではあるが大腸菌DNAがこのような配列からウィルス粒子に取り込まれる。すると、このようにして出来たファージはウィルス遺伝子を含まず細菌の遺伝子だけを持つことになる。このようなファージが他の菌に感染すればファージの増殖の場であった細菌のDNAを持ち込む事になる。

　導入される細菌の遺伝子はラムダファージの場合のようにgalとかbioに特定されず色々なマーカーが導入される。これが、一般（普遍）形質導入(generalized transduction）と呼ばれる所以である（図13-4）。

　遺伝子地図上の3つのマーカーの相互の位置を推定せよ。

　答えは、thr−ara−leuである。何故か。

　大腸菌の遺伝子地図は接合で遺伝子が導入される時間（分）で表される。2つの遺伝子間の距離をd分、ファージの遺伝子サイズをL分とすると、両方の遺伝子マーカーが形質導入される頻度は次の式で表される。

　　　　cotransduction frequency =(1−d／L) ^３

　P1ファージのサイズは2.2分である事が他の実験から分かっている。一方、araとthrが一緒に導入される頻度はほぼ5% (4.3-6.7%) である。依って、0.05=(1−d/2.2)^３から、d=1.8分となり、2.2分に近い値となる。
　大腸菌染色体（より一般には細菌染色体）上の遺伝子相互の位置関係は、十分離れている遺伝子の場合は接合の時間で、相互距離がより短い場合はcontransductionで、もっと短い場合は conjugation 実験などでの相同組替え頻度で推定する事が出来る。

　2つのマーカー間の相同組替え頻度が1%の時、1マップユニット(m.u.)離れていると云う。ここで、1m.u.がDNAにして何塩基対にあたるか疑問になる。種や部位によってDNAの長さあたりの組替え頻度が異なるのでいちがいに幾つとは云えないが、大腸菌で1m.u. がほぼ5×10^３nt という推定をしている文献がある（D.G.Catcheside. The Genetics of Recombination. Edward Arnold.1977 Table 4, 2 ）。

＜問い＞　大腸菌の遺伝子の全部を接合で導入するにはほぼ80分かかる。大腸菌の遺伝子のサイズはう上述した通りである。1分で入る遺伝子のサイズは、何m.u.になるか。

＜問＞組み換え頻度の計算にはHfrによる遺伝子導入実験を利用すればよい。どのような実験を組めばよいか、考えてみよ。

13−5：制限と修飾

　Arberは大腸菌にラムダファージを感染させる実験で次のような現象を見いだした。ラムダファージを大腸菌C、K、Bそれぞれの株で増殖させ、それぞれの大腸菌C、K、B株での感染効率（プラーク形成効率）を調べた。

結果を表にすると次のようになった。

　即ち、Cで増殖させたファージのK及びB株への感染効率はC株の1万分の1以下である。しかし、一旦、K或いはBで増殖出来たファージの感染性を調べると、それぞれ、K株或いはB株にはC株と同様の効率で感染する。

　これらのファージは、K株或いはB株にもC株と同じ効率で感染できるようになった変異株の可能性がある。もし、変異株であれば、例えばK株によく感染するようになったファージはもう一度C株で増殖させてもK株C株いずれでもよく感染する筈である。実際は、C株で増殖させると、K株に効率よく感染する性質を失い、元に戻ってしまう。これが制限 (restriction)と修飾 (modification)の発見の端緒となった。

　この現象は次のような機構による事が分かった。

（1）K或いはB株にはC株で増殖したファージDNAを切断する酵素がある。これが制限酵素である。

（2）K或いはB株で一旦増殖させると、それぞれの株で良く増殖するようになるのは、K或いはB株で増殖している間にK或いはB株にある制限酵素で切断されないようにDNAが修飾(modification)される為である。K株での修飾制限とB株での修飾制限は異なるので、K株で増やしたファージはB株で制限を受け、B株で増やしたファージはK株で制限を受ける。上の実験でK株或いはB株で僅かに感染したファージは制限酵素で切断される前にDNAが修飾され増殖し得た希れな個体である。

（3）DNAの修飾はDNAのメチル化である事が分かった。制限酵素は特定塩基配列を認識するが、その部位がメチル化されていると認識されない。つまり、制限酵素で切断されなくなる。

（4）制限酵素には３つのタイプがある。

（5）Arberの行った実験に関与するのはﾀｲﾌﾟ１制限酵素である。　制限・修飾系は大腸菌の側に立って考えると、外からファージなどの遺伝子が入って来て勝手に増殖したり住み着くのを防ぐ一種の防衛機構と考えることが出来る。

＜問い＞上に示した実験で大腸菌Ｃ株のrestriction-modification系はどうなっているか？

13−6：DNAのメチル化

　上述したように、DNA合成の際のエラーにより塩基のミスマッチが出来た時、親DNA鎖でなく間違った塩基を持つ新しいDNA鎖を修復しなければならない。この時親DNA鎖と新生DNA鎖を区別するのが大腸菌と腸内細菌ではメチル化である。この場合のメチル化はdam遺伝子産物が行う。即ち、

　　　　5'−G^mAT C−3'　　　　
　　　　3'−CT^mAG−5'（^mメチル化）

　新しく出来た鎖が親DNA鎖と正しく塩基対を作っていない場合、これをMutSが認識しその部位に結合する。新しいDNA鎖に変異が入ったとする。その上流（5'側で）のどこかに3'-CTAG-5'がある筈であるが、それはメチル化されていない。他方その部位での古いDNA鎖はメチル化されている。MutH、MutLはMutSとの相互作用でこの場所にくっつき、メチル化のない新しい鎖に切れ込み（nick）を入れる。するとpolIが5'から3'へと消化しながら同時に塩基をつないで行く(nick translation)（図13-6）。damはメチル化という点ではタイプ２の修飾酵素に似ており、進化論的には共通の起源を持つと考えられている。