第６章　遺伝子とその発現

　細菌のRNA 合成、蛋白合成の概要を説明する。動物細胞（真核細胞）と基本的に違う点がある。

1. 細菌には核がない。動物細胞には核がある。核は核膜で細胞質と分けられている。即ち細菌では核膜を挟んだDNA転写産物メッセンジャーRNA(mRNA) の核細胞質移行の過程が無い。

2. この為、細菌では DNA合成、RNAへの転写、RNA から蛋白への翻訳が同時に起こる（図6）。
   　DNA複製が盛んな菌では複製１ラウンド終わらない内に次のDNA合成が始まる。そのような状態では、DNA複製開始点（origin）に近い遺伝子はコピーが多くなる。この様な事を反映して、リボソームRNAや蛋白のように増殖の良い菌で大量の発現を要求される遺伝子はDNA複製開始点に近い部位にある。

3. 動物細胞では、核内で転写された RNAは、改変を受けて細胞質へ送りだされる。核内の RNAはDNA配列をそのまま反映しているが、細胞質に出るRNAは5'端に cap構造を持ち3'端にポリＡ配列を持つ。多くの遺伝子はintronを持ち、細胞質に輸送されたRNAはこれを失っている（splicing）。細胞質に輸送され蛋白合成の鋳型となる部分を exon と云う。

4. 一般的に云って動物細胞の mRNAはmonocistronicであるが、細菌のmRNAは polycistronicである。即ち、動物細胞の mRNAは翻訳開始点が一つなので、１つの蛋白しかコード出来ない。
   　細菌細胞では、mRNAは複数の翻訳開始点を持ち、複数の蛋白をコードする。この複数の蛋白は、機能的に同時に発現される事が必要なものである。例えばラクトースの細胞への取り込みと分解を行う酵素群は１つのmRNAから翻訳される。転写調節により、必要な遺伝子群の発現を一度に調節出来る訳である。
   　このような転写単位をオペロン（operon）と云う。

5. 動物細胞に感染するウイルスで、１本のmRNAしか出来ないウイルス、例えばポリオウイルスは、１種類の蛋白しか作れない。しかし、ウイルスは、ウイルス粒子蛋白、RNA複製酵素など複数の蛋白を必要とする。この場合、巨大な蛋白がまず出来て、それが必要な蛋白に切られていく（post-translation cleavage）。

6. 大腸菌では DNA 依存 RNA ポリメラーゼは１種類である。真核細胞ではDNA 依存 RNA ポリメラーゼは３種類ある。
   　PolI はrRNA（18S,5.8S,28S）を、PolII は mRNAを、PolIII は5SRNAとtRNA を転写する。

6−1：遺伝子発現の調節

　細菌は環境に応じ、飢えるか、大宴会か、の生活を送っている。エサがあれば直ちに取り込んで利用し、無くなれば速やかに一切無駄なエネルギーを消耗しない窮乏生活に入らなければならない。
　その代謝調節は大変効率よく且つ素早い筈である。一体どうやっているのだろうか？

　代謝は酵素によって進行する訳だから、代謝の調節は言い替えると、酵素の合成あるいは活性の調節である。また、環境に速やかに対応すると云うことは、物質の取り込みとカップルした現象である筈である。

　調節には種々の機構が知られている。まとめると次の様になる。
　1．Stringent control
　2．Genetic constitution
　3．Control of operon expression
　4．Regulation of enzyme activity

6−2：Stringent Control

　細菌を新しい培地に植えると、一定の時間を置いて対数増殖期に入る。栄養や酸素を消費し尽くすと、増殖が止まり、静止期となる。栄養を加えれば、直ちに増殖が快復する。
　この時、細胞のRNA量を調べると、細胞増殖とRNA量は平行して動いている事が分かる。静止期の培養に栄養を加えると、まず、RNA合成が回復し、次にDNA合成が始まる。このRNAの大部分はリボゾームRNAである（図6-2）。
　DNA合成、RNA合成、蛋白合成におけるヌクレオチド或はアミノ酸が重合する速度は、細胞増殖の速度に拘らず一定である、従って総合成量は合成開始の頻度で決まる。

6−3：転写とDNA複製の速度

　細胞増殖速度や転写産物の量に関わらず、次の値は、37度で一定である。

　DNA： 800 nucleotides / sec
　RNA： 80 nucleotides / sec
　protein： 16 amino acids / ribosome / sec.
　DNA複製の時、二重鎖DNAのsupercoilを解きながら動くgyrase の速度は100 supercoils／minである。相同組換えの際、RuvBが関与するbranch migration(後述)は10〜20nucleotides／secである。

　RNA合成の方がDNA合成よりのろい。そうするとDNA複製分岐点(replication fork)がRNA polimeraseに追いつき得る。又、DNA合成方向とRNA合成方向が逆向きでぶつかる事もあるだろう。この様な時、どんな事が起こるのだろうか。

6−4：mRNAへ翻訳産物が結合する事による翻訳調節

6−5：遺伝子構造（Genetic Constitution）によるもの

　細菌では、DNA複製、RNA転写、蛋白への翻訳が同時に起こる。従って、DNA 合成を盛んにやっている菌では、DNA 複製開始点(Ori) のすぐ下流の遺伝子は遥かDNA 複製終止点(Ter) 近くの遺伝子よりコピー数が多くなる。

6−6：Control of Operon Expression(オペロン発現調節)

　この中には、次のものが含まれる。
　　１．Catabolite repression
　　２．Regulation by repressor or by inducer
　　３．Transcription regulation coupled with translation
　　４．Anti-termination
　　５．Choice of transcription initiation site σ factor
　　６．RNA stability

6−7：Lactose Operon

　ラクトースオペロン(lactose operon)を例にしてcatabolite repressionとrepressor又はinducerによる調節を説明する（図6-7-(1)）。

　実験１．グルコース培地で飼っていた大腸菌をラクトースを含む培地に入れる。時間を追い、ラクトース量と β-galactosidase ( lactoseをglucoseとgalactose に加水分解する酵素）を量ると実験１のようになる。

　実験２．上の実験で菌を植え込む培地をglucoseとlactose 両方を含むものに変える。同様に糖とβ-galactosidase (β-gal )の量を量る。実験２の様な結果になる。

　実験１では、15分の lag の後β-gal が増加し始め60分で全菌蛋白の3％を占めるにいたる（これは、1,000倍の増加である）。β-galにより、lactose はglucose と galactose に分解され、量が減って行く。つまり、lactose が培地に加えらえた事でβ-gal が誘導 (induce) される。従って､それまでは、β-galの発現が抑えられていた、と考えられる。実験２では、glucoseがある間は lactose の利用が抑えられ、glucose が無くなって初めて lactoseが消費され始める。つまり、 glucose があると、lactoseがあってもβ-gal は induce されない。つまり glucose はβ-gal の発現を抑える。glucose は lactose の代謝産物(catabolite) なので､glucose存在下でβ-galの発現が抑えられていることをcatabolite repression と云う。

　分子機構は以下の通りである（図6-7-(2)）。

1. lactose が無い状態では repressor は４量体となり operator に結合し RNA polymerase のpromoter への接近を妨げる。結果、転写が押えられる。
2. lactose を培地に入れると、lactose のisomer であるallolactoseとrepressor が結合し､repressorはoperatorに結合出来なくなる。その結果、RNA polymeraseはpromoter に結合し転写が可能となる。しかし、RNA polymeraseが転写を始めるには上流のCAP siteにCAPという蛋白が付く必要がある。これが実験２に関係する。
   即ち、
3. glucose が存在すると、glucose の取り込みにカップルして、リン酸化されたIII^g/c が脱リン酸を受ける（図4-(6)参照）。
4. ATP から cAMP を作るadenylate cyclase はリン酸化された IIIglc を必要とする。glucose が取り込まれると、III^glcは脱リン酸化されcAMP が合成されない（図4-(7)参照）。
5. lactose operon の promoter に RNA polymeraseがつくには、CAP (catabolite activator protein ) とcAMPが結合しdimer になり、promoter 上流の CAP site に結合する必要がある。

6−8：レプレッサーとオペレーターの結合・解離

　オペレーターに付いていない時レプレッサーはどこにいるのだろうか。もし、これが細胞質の中を自由にふらついているとすると、lactoseの供給が無くなり、lactoseがレプレッサーから外れても、直ぐオペレーターにくっ付 き、オペロンをオフにする訳には行かないのではないか、と云う疑問が起こる。そこで、lactoseの結合したレプレッサーは細胞質にフリーに漂っているのではなく、DNA鎖上にランダムにくっ付いているのではないか、と云う仮説が生まれた。

　そこで、オペレーター部位とそれと同じサイズのそれ以外の部位へのレプレッサーの結合を調べた。レプレッサー単独の場合、オペレーターへの結合が2x10¹³（相対単位で、大きい値の方が結合が強い）であるのに対し、lactoseが付くとこの値が2x10¹⁰となる。一方、他のDNA部分への結合は、何れも2x10⁶であった。従って、　　レプレッサー単独の時のオペレーターへの結合特異性は
　　　　　　　　2x10¹³/2x10⁶=10⁷　
　であるのに対し、lactoseが付くと
　　　　　　　　2x10¹⁰/2x10⁶ =10⁴となる。

6−9：アラビノースオペロン

　アラビノースオペロンは、CAP蛋白によるCatabolite repressionを受け、且つ、アラビノース存在下でONになる、と云う点でラクトースオペロンと良く似ている。

　しかし、次のような点で基本的に異なる性質のある事が分かった。
　(1)araC遺伝子はアラビノースオペロン(AraABD)発現に必須であり、正の調節(inducer)をすると考えられた。処が

　(2)アラビノースの存在に依存せずアラビノースオペロンをONにするようなAraC変異株を分離しAraCの部分diploidを作り、アラビノースによるオペロン誘導を調べると 野生型の表現型を示した。もしAraCがinducerであれば常にオペロンがONとなる変異AraCの表現型を示す筈である。

　この様な、「理屈に合わない」点を解明しようとして研究がなされた。参考書として初めに紹介した本の著者、Schleifは以下に述べる現象の解明に大きな貢献をした人で、その研究の筋道が紹介した本に興味深く述べられている。

　アラビノースオペロンで特徴的なのは、DNAの折れ曲がりである。折れ曲がりの存在を示唆する実験的証拠として、I₁とaraO₂間に塩基対を挿入した実験がある。

　DNAの１らせん回転分（helical turn）の10塩基対の挿入ではなんら影響を受けないのに、半らせん回転分に当たる５、或いは、15の塩基対を入れるとaraCによるrepression効果が無くなる事が観察されている（+5の法則と仮に呼ぶ）。半回転すると、折れ曲がった時、お互いに向き合う領域の一方が外側を向いてしまうのでrepressionの現象が無くなると解釈される。

　真核細胞で転写効率を上げるエンハンサー蛋白がプロモーターから遥か離れたエンハンサー部位に付き、DNAの折れ曲がりによってエンハンサー蛋白がRNA合成に関わる蛋白をリクルートする場合にも+5の法則が存在するケースがある。

　araCにアラビノースが結合すると、araCの構造変化が起こり、それによりDNAへの結合様式が変わる点は結果が逆なだけでラクトースオペロンのレプレッサーの場合と全く同じである。
　又、アラビノース結合araC二量体がプロモーター上流のaraIに付きRNAポリメラーゼをプロモーター部位にリクルートする点は、後述の、ラムダファージにおけるレプレッサーcIが自分自身のオペレーター／プロモーター領域OR1、OR2に付きRNAポリメラーゼを付きやすくするのと良く似ている（図13-2-5参照）。

6−10：Regulation coupled with translation（翻訳連動転写調節）

　動物細胞では、核で mRNA が出来、それが細胞質に輸送されて翻訳が起こる。つまり、転写と翻訳の場が異なる。従って、翻訳が転写に影響を与える機会は無い。

　細菌のアミノ酸合成に関わる operonであるtrp、 phe、 his、 thr、leu 等では、第一段階の調節として, lactose operonと同様 repressor による調節がある。この場合は、それぞれ合成されるアミノ酸が repressorと結合することによりrepressorがoperator に結合できるようになり、転写が抑えられる。

　しかし、これらの operonには第二段階の調節がある。これが翻訳に連動した転写調節である。

　トリプトファン (trp) operon 　を例にとる。

　promotor-operator に引き続き、トリプトファンをコードするtriplet (UGG)が続く配列を持った短い読み取り枠 open reading frame (ORF) があり、UGA のstop codonで終る。このORFをtrpLと呼ぶ。

　トリプトファン合成に関与する酵素をコードする遺伝子trpE,trpD, trpC, trpB, trpA は trpL の下流にある。もし、trpL のすぐ下流で転写が止まると、トリプトファン合成酵素のコード領域は転写されないままになり、trpL のみをコードする短いmRNA だけが出来ることになる。

　tryptophan の存在下では、２つの trp コドンを読み取り stop コドンでリボゾームが止まる。すると、３−４の RNA stem-loop 構造が出来、転写が終わり RNA は DNA から外れ、結果、trpL のみをコードする mRNA が出来る（図6-10上）。

　tryptophan がない場合、２つの trp コドンの前でリボゾームが止まり、２−３のRNA stem-loop が出来る。 結果、３−４の stem-loop が出来ないので、 RNA は DNA から外れず転写が続行する。

　この時、 trpL の翻訳は trp コドンの処で止まるが、原核細胞ではそれぞれの遺伝子(cistron)を独立に翻訳する内部翻訳開始点(internal   ribosomal　entry site)があるので、下流の trpE , trpD などは翻訳されることになる（図6-10下）。

　トリプトファン合成酵素をコードする遺伝子 trpE、trpD、trpC にはトリプトファン codon は存在しない。従って、トリプトファンが培地中に無くても、トリプトファン合成酵素は出来る仕組みになっている。これは、転写の anti-termination の一種である。以上はYanofskyが1979年に出した非常にエレガントな仮説である。

6−11：もう一つの転写終止阻害(antiterminatioin)

　蛋 白とRNA polymeraseの相互作用を介したもう一つの anti-termination がある。ラムダーファージでは、初期遺伝子の転写が済むとRNA polymeraseは転写を止める。初期遺伝子であるN蛋白はこのRNA polymeraseと相互作用をして、RNA polymeraseをさらに下流の転写を可能にする。

　原核細胞での転写停止は次の２つの型がある。

　ρ因子に依存しないもの
　ρ因子に依存するもの

　前者は転写が最点迄進むと mRNA の3'側に特徴的なヘアピン構造が出来てこれがシグナルとなりRNA ポリメラーゼが RNA から外れ、転写が止まるものである。トリプトファンオペロンのtrpL翻訳後の転写停止はこの例である。後者は転写停止にρ因子を必要とするものである。

　Ｎ蛋白は、ρ因子依存性転写停止に関与する。RNAポリメラーゼが転写開始点を認識するにはσ因子が必要であるが、転写中にある部位に来るとσ因子は 宿主Nus蛋白と置き代る。転写終止に関わるρ因子は mRNA の5'からmRNA に乗っかり3' 側の方に移動する。Nus蛋白- RNA ポリメラーゼが転写終止点迄来ると、追いついて来たρ因子の作用により、転写複合体はDNAから外れる。

6−12：シグマ因子による転写operonの選択

6−13：Retroregulation：mRNAの部分分解による発現調節

6−14：真核細胞に於ける転写調節

　ここで、真核細胞の転写調節につき簡単に触れておく。
　例えば、ヒトゲノムは100,000個の遺伝子を持つと推定されているが、このような多数の遺伝子を発生段階に応じて正確に発現させるには、微細な調節が必要であることが予想される。それには多数の調節因子が必要とされるであろう。実際、細菌とは異なり、多数の蛋白が転写に関っている。

　大きく分けると３つのカテゴリーに分けられる。Activator、Mediator complex、 RNA polymeraseを含む基本転写複合体（basal transcription complex）である（図6-14）。

　Activatorは真核細胞には数百種あると云われている。遺伝子部位から可成り離れて存在するenhancer配列にActivatorは結合する。基本転写複合体はTBP（TATA binding protein）、TAF (TBP-associated factor）、RNA polymeraseからなり、TBPはpromoter配列にあるTATAA配列を認識する役割を果たす。つまり、細菌のσ因子に似た働きをしている。

　Ubiquitination
　ubiquitinが付くことをubiquitinationと呼ぶが、細胞内での蛋白の分解に必須な過程である。ubiquitinationには複数の酵素が関与し、ubiquitinの付いた蛋白はproteasomeと呼ばれる構造体の中で分解される。

　細胞内の不要なシグナル（即ち、蛋白の酵素機能）を消失させる為にはその酵素を分解しなければならない。サイトカインで刺激された細胞を例にとると、その細胞でサイトカインのシグナルが伝達するには、直ちにIkBのシグナルを消さなければならない。細胞周期を考えると、細胞周期が上手く廻るには、特定の酵素蛋白がタイミングよくその時だけ機能する必要がある。その為には蛋白が合成されるだけでは不十分で、要らなくなったら直ちに無くなって貰わなければならない。この様に考えると、壊すと云う一見非生産的な過程が複数の酵素により調節を受けている事は理に叶った事である。

6−15： mRNAから蛋白への翻訳

　mRNAの持つ情報を蛋白に読み取る場は、リボソームである。蛋白合成は、３つのステップからなる。開始（initiatioin）、伸長（elongation）、終止（termination）である。

　最初に起こることは、特別な形のメチオニンの付いたfMet tRNA（N-formylethionyl tRNA）とmRNAが30S ribosomeに付くことである。ここで、fMet tRNAはanticodonにより、mRNAの開始コドンAUGと結合している。そのリボソーム上の場所をP site と云う。これに、50S subunitが付き伸長反応が始まる。アミノ酸の付いたtRNAがリボソームのA （acceptor）siteにつきP （peptidyl）siteの伸長中のペプチドのC末アミノ酸と次々に重合する。これらの反応には複数の翻訳開始因子、翻訳伸長因子蛋白、エネルギー源としてのGTPが必要とされる。翻訳の停止は翻訳停止コドンによる。

　リボソームは複数のリボソーム蛋白とリボソームRNAからなる（細菌の場合、蛋白は少なくとも50、RNAは３つ）。分子量も非常に大きい（細菌のリボソームの分子量は2.6x10^６ダルトン）。このリボソームを場として、伸長中のペプチド鎖にアミノ酸が順次転移し蛋白合成が起こる訳である。ここで起こる疑問は、この反応を行うのはどの分子かと云うことである。リボソームの蛋白か、RNAか、或いはそれ以外の酵素か、と云う問題である。最近、大腸菌のリボソームの構造解析から、この反応を触媒するのは蛋白ではなくリボソームの23SRNAが、そのリボザイム活性により、アミノ酸のペプチド鎖への転移を触媒するのではないか、と考えられ始めている。

6−16：酵素活性調節(Regulation of Enzyme Activity)

　上に述べたのは、mRNAの発現調節を介した酵素量の調節である。この他の調節としては、出来上がった酵素の活性を変えるものがある。上に述べた、IIIGlc がリン酸化を受けIIIGlc-P となりadenylate cyclaseを活性化するのは、この一例である。
機構として二つある。

1. Covalent modification:
   例 phosphorylation, adenylation, acetylation, methylation
2. Ligand binding, modulator binding

　１．はリン酸化、アデニル化などによる酵素活性の変化である。

　２．は、allosteric inhibitionとも呼ばれる。A の物質が酵素 E と反応しB の物質が出来るとする。B が沢山溜ると E と反応し A を認識させなくする。A と B とは構造的に何等関係ないので、基質の競合ではない（図6-16） 。

　考えてみるとA と B とを遺伝的に結び付けるものはない。どうして、このような機構ができたのか、進化論的に謎である。

　EmbdenｰMeyerhof Pathway, TCA Cycleでもこのケースは多くみられる。

6−17：真核細胞に於ける蛋白の核膜輸送

　細菌と異なり、真核細胞は核を持つ。即ち、核と細胞質の２つのコンパートメントを持つことになる。蛋白により、核、細胞質それぞれに局在する必要がある。これが上手く行かないと折角蛋白として発現しても機能しない。

　次第に蛋白の核ー細胞質の行き来の機構が明らかになって来ており、図6-17はその模式図である。核膜には孔があり（nuclear pore）、蛋白はここを通る。

6-18：蛋白のスプライシング、intein

1990年頃、酵母の遺伝子発現を研究している途中で、コード領域が発現蛋白よりも遙かに大きいにも関わらず、RNA intronが見つからない現象に遭遇し、蛋白レベルで一部の切り出しがあるのではないか、と推定された。しかし、切り出し前に当たる高分子の蛋白が検出されないので信用されぬままであった。 　1993年、Perler等が、除去されると推定される部分にあたる配列を別の蛋白に挿入し低温で精製し、その上で温度を上げてやると、この部分が切り出される事を報告した。以来沢山の報告が上がっていて、データベースInBase (www.neb.com/neb/inteins.html) が出来ている。

　　機構としては蛋白が畳み込まれ立体構造を取ると同時に自然にinteinのＣ末側配列（C-extein）がN末配列（N-extein）に取り付いて直ちにintein部分が外れると云うものである。温度やpHの変化でinteinの切り出しをコントロール出来るので、例えば、宿主に毒性のある蛋白を発現したい場合、その遺伝子の中にintein配列を挿入して発現させ、精製し、pHを変えてinteinを除去し目的の蛋白を精製するなど応用面も広い。