微生物遺伝学演習

演習１．次の文章を読み、下の質問に答えよ。

1. 野性株大腸菌（wt）とlactose代謝経路に変異のある大腸菌（#1、#2、#3）にF'lacを導入する。
2. このF'lacは、正常な promotor-operatorと共に lactose 利用に十分な遺伝子（lacZ，Y，A）を持っている。しかし、lac operon の repressor は持っていない。
3. #1にこの F'lac を導入すると、#1の菌は lactose を唯一の炭素源として生育出来、β-galactosidaseの誘導には lactose を必要とする。しかし、glucose の存在は β-galactosidase活性水準に影響しない。
4. #2にこのlac'Fを導入すると菌は、lactose を炭素源として利用し、かつ、lactose の存在如何によらず、β-galactosidase 活性は高い。しかし、glucose を培地に入れると、β-galactosidase の活性はガタンと落ちる。
5. #3にこのlac'Fを導入しても、菌は lactose を利用した生育をせず、lactose、glucoseの存在如何によらず、β-galactosidase 活性は出ない。

〈質問〉

1. wtと#1の菌では、β-galactosidaseの発現に、なぜlactoseを必要とするのか？可能性　を挙げよ。
2. #2の菌でglucoseがβ-galactosidaseの活性水準を落とす機構としてどういうものが可能か？
3. なぜ、#1の菌はglucoseの影響を受けないのか？可能性を挙げよ。
4. なぜ、#2の菌はβ-galactosidase発現にlactoseを必要としないのか？可能性を挙げよ。
5. なぜ、#3の菌はどのような条件下でもβ-galactosidaseを合成出来ないのか？
6. cAMPを培地に加えると菌に取り込まれる。β-galactosidaseの活性はどうなるか？　それぞれの菌について、予想される結果を述べよ。その理由も述べよ。

解説

　Rは、lactoseがなければ lac operon の operator(0) にくっつき、この operon の発現をおさえる。lactose があるとその誘導体 allo-lactose が R と結合し、operator につかなくなり lac operon は ON になる。

　lactose operon の発現は、lactose operon 上流の CAP site に、CAP（catabolite activator protein）が結合し、転写を促進することで、もう一つの調節を受けている。

　CAP は glucose 存在下では CAP site に結合しない。これは glucose の細胞への取り込みにより、cAMP を作るアデニレートシクラーゼ活性がガタンと落ち、かつ、CAP は cAMP と結合して始めて CAP site に結合出来るからである。従って、glucose があると、正常の菌(wt)では lac operon はOFFになる。

　問題１はwtと#1の lac operon の発現に何故 lactose が必要か、というのであるが、上の説明で明らかなように、wtと#1にはI遺伝子が正常に機能しているから、と推定出来る。

　問題２は、wtと#2では何故 glucose が lac operon を OFF にするか、という問題である。これも上の解説通りである。

　問題３は、#1が glucose の影響を受けない理由を聞いている。答えは一様ではないが、 glucose を取り込めないか、取り込んでもアデニレートシクラーゼが低下しないか、或いは、cAMPを壊す酵素（phosphdiesterase）が欠損しているか、要するに、glucose により cAMP の量が減らない変異株というのが答えである。

　問題４は、何故#2は、lac operon の発現に lactose を必要としないか、との問いである。おそらくI遺伝子に欠損があるからである。

演習２．次の文章を読み、下の質問に答えよ。

　（質問）

1. 始めの大腸菌の変異はどの様なものか？
2. 何故この変異はlacYとlacAの合成をも止めるに至ったか？
3. Type１復帰変異はどういうものか？
4. Type２復帰変異はどういうものか？
5. Type３復帰変異はどういうものか？
6. ループ部分は1200ヌクレオチド位であった。どの様な遺伝子が考えられるか？

解説

　下の方の図で、始めの変異株の DNA の方が loop を作っている事に注目する。また、その長さが 1200bp である事からトランスポソンらしいと見当をつける。トランスポソンは Jumping gene と云われるように飛んで歩く遺伝子である。これが、Z 遺伝子の真ん中に飛んできたと推定する（問題１の解答）。そうすると、トランスポソンの中に転写停止シグナルがあれば、転写はそこで止まるので、Y,A を欠く mRNA が出来る（問題２の解答）。Type1 復帰変異は転写停止シグナル部位に変異が起きて、下流のY、Aまで読み取るようになったか、変異により新たな promoter が挿入 DNA に出来たかである（問題３の解答）。Type２ は正確なトランスポソンの切り出しである（問題４の解答）。Type３ は rho の変異でトランスポソン挿入によって出来た停止シグナルで転写がとまらなくなった、と考えればよい（問題５の解答）。

演習３．下の文章を読み、質問に答えよ。

（質問）

1. sxy 遺伝子の転写開始部位はどこか？
2. sxy 遺伝子の転写にはラムダファージ遺伝子のどの部分が必要とされるか？
3. 温度を変えた場合の sxy 遺伝子発現の変化はどう説明されるか？
4. この系の問題は温度を上げて20分すると、sxy の生産が下がってしまうことである。
   ラムダのcro 遺伝子に変異を入れると、sxy の生産は持続する。その理由は何か？

解説

問１：ラムダファージの promoter は cI 遺伝子を挟んだ PL とPR、cI をコードする mRNA の PRE、PRM、int をコードする mRNA の PINT があるが、ここでは場所から PR 以外無い。

問２：ラムダファージが菌に感染すると、N と cro を転写した処で転写が止まる。N とcro の蛋白だけが出来る訳であるが、N の遺伝子産物は転写停止を妨げ（anti-termination）、N と cro のより下流迄転写が継続するように働く。従って、sxy の発現には N 遺伝子を必要とする。

問３：低温で sxy 合成が止まり、高温で合成が起こるのは、cI が温度感受性の為である。cro，cII と読み取られると、cII 蛋白は、cI の promoter である PRE に働き、cI（レプレッサー）の転写を促進する。cI は PR から右側への転写を抑える。この為 cro 以下、下流の読み取りは OFF となる。

問４：これは、ラムダファージの遺伝子調節の上で最も理解しにくい部分である、cro と cI の微妙なバランスを理解しなければならない。PROR は cI および cro が結合する場所を３つ持っている。左から O3、O2、O1とする。cI は O1、O2、O3、の順に付いていく。つまり cI の量が増えれば一番左の O1 まで付く。cro は逆の順で付いていく。

　　上の問題では、高温なので cI は壊されており、このファクターは無視して良い。すると、O３、O２まで cro がついたのでは RNA ポリメラーゼは PＲ につき得るが、cro の量が増加しO１までつくようになると、ポリメラーゼがプロモーターにつけなくなる。すると、右側への写は OFF になる。従って、cro 遺伝子をノックアウトすると、sxy の生産は持続する。ラムダファージの感染サイクルを復習すること。

演習４．次の文章を読み、質問に答えよ。

（質問）

1. 何故、変異大腸菌ではラムダの中後期遺伝子の転写が起こらないのか？
2. N 遺伝子の変異したファージの一部が上の変異大腸菌で増殖できる機構は何か？
3. N 遺伝子の正常な機能は何か？
4. rho 因子を欠く大腸菌では N 遺伝子の変異したファージは増殖できるか？

解説

問１．N 遺伝子産物は anti-terminator なので正常な RNA ポリメラーゼとは反応し、左は cIII，xis，intと、右は cro，cII，O，P，Q...と転写を進行させる筈である。しかし、大腸菌の RNA ポリメラーゼが N 蛋白と反応出来ないような変異を持っていると、anti-termination は不可能である。

問２．変異RNAポリメラーゼと反応出来るようなN蛋白の変異が起きればよい。

問３．anti-termination

問４．N 及び cro の転写後の転写停止は rho 依存性である。したがって、rho を欠く菌では N 遺伝子に変異があっても、転写停止がおこらず、ファージは増殖出来る筈である。

演習５．次の文章を読み質問に答えよ。

　菌は常に毒素を生産しているわけではないので、おそらく何かが inducer の役割を果たし制御が行われていると考えられる。

　この遺伝子とは連鎖していない toxR 遺伝子に変異が起こると、毒素生産に影響が出てくる。toxR が欠損すると、toxA、toxB の転写が止まる。toxR 遺伝子の中の殆どの point mutation による変異は同様な効果を持つが、一部の point mutation では毒素があらゆる条件で生産され続ける。

　毒素生産と同時に調節されている遺伝子は線毛（pilus）の遺伝子である。線毛は細菌が細胞に接着するのに重要な働きをする。上に述べた toxR 遺伝子変異は線毛遺伝子の発現に対しても toxA、toxB に対するのと全く同じ影響を与える。線毛遺伝子は toxR、toxA,toxB とは別の遺伝子座にある。

　toxA、B 遺伝子の欠損は線毛の発現に影響せず、毒素生産も線毛発現に影響を与えない。

　toxA、B の operon 内の変異には、毒素を常に発現し続けるようになるもの（constitutive）がある。この constitutive な発現は toxR に依存しない。また、この変異で線毛遺伝子発現が constitutive になる事もない。

（質問）

1. toxAB および線毛遺伝子の発現に対する toxR の役割は何か？
2. 上に、toxR の変異に２種類ある事を述べた。それぞれ如何なる機構によるものか説明せよ。
3. toxA、B と線毛が同時に調節されている機構としてどの様なものが考えられるか？
4. toxAB operon 内の変異により、toxR に依存しない constitutive な毒素生産に至る機　構を推定せよ。
5. 希に毒素生産が異常に高い菌が取れる。このような菌が取れるためには toxAB の両側の反復配列が必要である。その機構を推定せよ。

解説

　酵素には外毒素と内毒素がある事を思い出そう。外毒素は A、B の二つのサブユニットから成る事が多い。A（active）は活性を担い、B（bionding）は細胞への吸着を担う。

問１．明らかに、toxR は toxAB と pili の発現を促進する positive regulator である。おそらく、CAP のように RNA ポリメラーゼがプロモーターに結合するのを促進していると思われる。もう一つの可能性はプロモーターを選択するシグマ因子が考えられる。

問２．大部分を占める変異は toxR が不活性化されたものであろう。常に毒素を生産する変異は、蛋白の構造変化で常に toxAB オペロンを ON にするようになったものであろう。

問３．toxAB と pili の遺伝子は toxR を転写に必要とする似たプロモーターを持っている。

問４．toxAB のコード領域の上流に toxR に依存しないプロモーターが挿入されればよい（例えば、トランスポソン）。

問５．おそらく、繰り返し配列を利用して遺伝子コピーが増えたのであろう。

演習６．

麻疹ウイルスは次の性質を持つ。

1. 電子顕微鏡で観察すると、コイル状のヌクレオカプシドを持ったエンベロープを持つ球形のウイルスである。
2. ウイルスは１本鎖 RNA を持つ。
3. ウイルス RNA は in vitro での翻訳の鋳型にならない。
4. 感染細胞はウイルス粒子蛋白より大きいサイズの蛋白を合成しない。

   このウイルスの感染サイクルのアウトラインを図説せよ。

演習７．次の文章を読み、質問に答えよ。

　ある細菌学者が急に痴呆状態になり、これが M.ikarechattus の感染によるものと判明した。このM.ikarechattus に感染する二重鎖 DNA virulent phage が最近発見され話題となっている。

　その phage は次のような性質を持つ。

（質問）

1. 初期 RNA がクロラムフェニコールにより合成阻害を受けない理由は何か？
2. 初期 RNA 合成が rifampicin 感受性、非感受性菌で異なる理由は何か？
3. 後期 RNA がクロラムフェニコールで合成阻害を受ける理由は何か？
4. 後期 RNA を転写する RNA ポリメラーゼの由来（phage か菌か）とその性質は？遺伝子 69 の役割は何か（可能性は一つとは限らないが一つ挙げればよい）？
5. もし、RNA ポリメラーゼの温度感受性変異菌株が得られたとする。これを用い、4の答えで出した仮説を証明するにはどのような実験をしたらよいか？その実験結果はどう予測されるか？ phage 感染の各ステージで合成される RNA とポリメラーゼとの関係に十分注意し回答せよ。

解説

　上の実験を纏めると、

問１．CM は蛋白合成阻害をする抗生物質である。従って、初期 RNA は宿主のすでに　ある RNA ポリメラーゼ（蛋白）で転写されると考えると、説明がつく。

問２．Rifｓ の菌には Rif に感受性の RNA ポリメラーゼがあり、Rifｒ の菌には Rif 耐性　のポリメラーゼがある。従って、このファージは宿主の RNA ポリメラーゼを初期 RNA 合成に使用すると推定されている事から、初期 RNA も同様な感受性を示す。

問３．後期 RNA が CM 感受性なのは、初期に後期 RNA 合成の為の RNA ポリメラーゼ（蛋白）が合成されなければならないから、と推定される。

問４．問３への解答から後期 RNA 合成の為のポリメラーゼの一部はファージがコードしている、と考えられる。ファージ遺伝子69の変異の本体の可能性として、

1. 69はシグマ因子で、それが変異すると、他のRNAポリメラーゼサブユニットは宿主由来でも後期遺伝子のプロモーターを認識しなくなる。

2. もう一つは後期遺伝子を転写するRNAポリメラーゼ自体をファージがコードしていて、それが変異すると、後期の転写は無くなるであろう。

問５．宿主のRNAポリメラーゼが温度感受性なので、もし、シグマ因子のみファージが　提供しているのであれば後期遺伝子は温度感受性であろう。（初期遺伝子は？）。もし、ファージがポリメラーゼそのものをコードしているのなら、後期遺伝子は宿主のRNAポリメラーゼの温度感受性にも関わらず温度に影響されないであろう。（初期遺伝子は？）

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